CÔNG CỤ SỬ DỤNG TRONG ĐỊNH LƯỢNG DNA

Giải pháp định lượng DNA chính xác tới từ Berthold Technologies

Có rất nhiều công cụ phù hợp với từng phương pháp định lượng DNA khác nhau, từ máy quang phổ kế đo thể tích nhỏ micro (small microvolume spectrophotometers) cho tới các dòng máy đọc khay vi thể phức tạp đa chế độ (multimode microplate readers). Do vậy, thiết bị cũng là một trong các yếu tố quan trọng cần cân nhắc khi lựa chọn phương pháp dùng để định lượng DNA. Hãy cùng tìm hiểu về các dòng dụng cụ sẵn có, phương pháp nào là phù hợp sử dụng cho những dụng cụ này, có những phụ tùng và vật liệu tiêu hao đi kèm nào được khuyên dùng.

 

HẤP THỤ QUANG HAY PHÁT XẠ HUỲNH QUANG?

ABSORBANCE OR FLUORESCENCE?

Phương pháp phổ biến nhất dùng trong định lượng DNA đó là đo ảnh phổ tia UV (UV spectrophotometry) và đo phát xạ huỳnh quang (fluorescence measurement) thuốc nhuộm gắn với DNA (DNA-binding dyes). Phương pháp đầu đòi hỏi một hệ thống phù hợp với phép đo độ hấp thụ (absorption measurement) còn phương pháp sau lại cần tới một thiết bị có thể sử dụng cho phép đo phát xạ huỳnh quang (fluorescence measurement). Vậy nên, chúng ta cần xác định phương pháp sử dụng trong định lượng DNA là gì trước khi quyết định xem nên sử dụng dụng cụ định lượng nào. Tìm hiểu thêm về các phương pháp định lượng DNA.

 

MÁY ĐỌC ĐỘ HẤP THỤ QUANG

ABSORBANCE READERS

Hai dòng máy phổ biến nhất được sử dụng trong định lượng nồng độ DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang (absorption measurements) đó là máy quang phổ kế đo thể tích micro (microvolume spectrophotometers) và máy đọc khay vi thể hấp thụ quang (absorbance microplate readers).

Máy quang phổ kế đo thể tích micro

Microvolume Spectrophotometer

Trước đây, máy quang phổ kế sử dụng chậu thủy tinh (cuvette spectrophotometer) là lựa chọn duy nhất để định lượng nồng độ DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang (absorption measurements). Tuy nhiên, ứng dụng này gặp phải rất nhiều hạn chế do lượng mẫu yêu cầu vào quá cao còn kết quả thu được từ thí nghiệm sinh học phân tử lại có thể tích quá nhỏ. Mặc dù độ nhạy của máy quang phổ kế sử dụng chậu thủy tinh (cuvette spectrophotometer) lại tốt hơn so với máy quang phổ kế đo thể tích micro (microvolume spectrophotometers), lượng mẫu mà nó yêu cầu vào lại quá lớn: 300-400 µL đối với chậu thủy tinh bán micro (semi-micro cuvettes) và 70 µL đối với chậu thủy tinh mang thể tích micro cực thấp (ultra-micro cuvettes). Đột phá thật sự trong ứng dụng ở phương pháp này là sự ra đời của dòng máy quang phổ kế đo thể tích micro (microvolume spectrophotometers) có khả năng đo một lượng mẫu rất nhỏ (thông thường là 1 µL). Do đó, việc sử dụng máy quang phổ kế chậu thủy tinh (cuvette spectrophotometer) không còn trở nên thịnh hành nữa, thay vào đó, máy quang phổ kế đo thể tích micro (microvolume spectrophotometers) trở thành sự lựa chọn hàng đầu cho thí nghiệm đo độ hấp thụ quang đơn mẫu (single sample absorption measurements).

Định lượng DNA bằng máy quang phổ kế đo thể tích micro (microvolume spectrophotometers) rất đơn giản và dễ dàng thao tác tuy nhiên giữa các lần đo mẫu tuần tự cần một bước ngắn làm sạch bàn đo khá tiêu tốn thời gian nếu số lượng mẫu cần định lượng là lớn. Do vậy, để tiết kiệm thời gian, máy đọc khay vi thể (microplate reader) được khuyên dùng nếu số lượng mẫu cần đo quá lớn.

 

Máy đọc khay vi thể hấp thụ quang

Microplate absorbance readers

Máy đọc khay vi thể (microplate readers) có thể đo rất nhiều mẫu trong một khoảng thời gian ngắn. Đĩa tiêu chuẩn có hai loại là 96- và 384- giếng nhưng một số máy có thể đọc đĩa lên tới 1536 giếng hay nhiều hơn nữa. Tuy nhiên, dòng máy này lại bị hạn chế ở khả năng tính toán nồng độ DNA nếu so sánh với máy quang phổ kế đo thể tích micro (microvolume spectrophotometers):

  • Nó cần lượng mẫu với thể tích lớn hơn để thực hiện phép đo. Khía cạnh này lại phụ thuộc vào loại đĩa và nhà sản xuất. Khay vi thể có mật độ đĩa càng dày đặc thì lượng thể tích tối thiểu yêu cầu lại càng thấp. Đa số khay vi thể tiêu chuẩn phổ biến (common microplate formats) đều có phiên bản sử dụng thể tích thấp. Tuy nhiên, trong đa số trường hợp, phép đo thực hiện trên khay vi thể (microplates) vẫn cần thể tích lớn hơn gấp nhiều lần so với lượng thể tích cần cho một phép đo trên máy quang phổ kế đo thể tích micro (microvolume spectrophotometers). Bạn sẽ tìm thấy thể tích làm việc tối thiểu (working volume) của các khay vi thể tiêu chuẩn (common microplate formats) trong bảng cuối nằm dưới bài viết này.
  • Khay vi thể polystyrene tiêu chuẩn (standard polystyrene microplates) không thể được dùng trong mục đích này bởi nó có khả năng chặn tia UV. Đa số các nhà cung cấp đều có khay vi thể đặc biệt (special microplates) mà tia UV có thể đi xuyên qua. Mặc dù chúng đắt hơn đĩa polystyrene (polystyrene microplates), chi phí đó vẫn phải chăng và thuận tiện hơn nếu so sánh với đĩa thạch anh (quartz microplates) hay đĩa có đáy thạch anh (quartz-bottom microplates).
  • Độ dày truyền quang (pathlength) là một nhân tố quan trọng trong phép tính nồng độ DNA (xem phần Các phương pháp định lượng DNA) lại phụ thuộc vào hình dạng giếng (well geometry) và thể tích mẫu (sample volume). Dựa theo công thức tính nồng độ DNA, độ dày truyền quang (pathlength) phải đạt được giá trị bằng 1 cm, do đó tham số chuẩn hóa độ dày truyền quang (pathlength correction) được áp dụng trong các phép đo sử dụng khay vi thể (microplate measurements). Tham số chuẩn hóa độ dày truyền quang (pathlength correction) có thể dễ dàng tính được nhờ phép đo độ hấp thụ quang của mẫu ở 900 và 975 nm.

 

Khay vi thể sử dụng thể tích micro dành cho định lượng DNA

Microvolume microplates for DNA quantification

Để khắc phục ba vấn đề trên, khay vi thể sử dụng thể tích micro (microvolume microplates) được áp dụng cho phép định lượng DNA. Loại khay vi thể này (microplates) sử dụng lượng mẫu rất nhỏ (thông thường là 2 µL), tia UV có thể truyền qua và có độ dày truyền quang (pathlength) cố định có thể dễ dàng áp dụng vào các phép tính mà không cần bổ sung các phép đo khác. Cho dù nó không mang nhiều vị trí đặt mẫu như khay vi thể tiêu chuẩn (standard microplates) (thông thường chỉ có 16 vị trí thay vì 96 vị trí), đổi lại, ưu điểm của nó lại nằm ở thể tích mẫu và hiệu suất làm việc cao. Để thuận tiện hơn trong quá trình định lượng DNA bằng dòng máy đọc khay vi thể (microplate readers) của Berthold Technologies, chúng tôi cung cấp đĩa µDrop (µDrop plate) với phần mềm MikroWin bao gồm các tệp tham số (parameter files) giúp đơn giản hóa phép đo và tính toán.

Nếu xét tới các dòng máy đọc khay vi thể (microplate reader), vấn đề cần quan tâm duy nhất đó khả năng đo độ hấp thụ quang bằng tia UV xuống tới bước sóng 230 nm (bởi đây là bước sóng được sử dụng để xác định độ tinh sạch của DNA). Máy đọc khay vi thể dựa trên kính lọc (filter-based) hay bộ phận đơn sắc hóa (monochromator-based) đều phù hợp cho ứng dụng này.

 

MÁY ĐỌC PHÁT XẠ HUỲNH QUANG

FLUORESCENCE READERS

Nếu phép định lượng DNA của bạn yêu cầu độ nhạy và độ đặc hiệu cao, bạn nên chuyển thay vì sử dụng phương pháp hấp thụ quang sang phát xạ huỳnh quang (fluorescence). Với phương pháp sau, bạn sẽ cần sử dụng tới huỳnh quang kế (fluorometer). Cũng giống trong trường hợp đọc độ hấp thụ quang (absorbance readers), huỳnh quang kế sử dụng chậu thủy tinh (cuvette fluorometers) không được áp dụng cho phép định lượng bởi nó đòi hỏi lượng mẫu đầu vào lớn. Vấn đề này đưa chúng ta tới hai lựa chọn: huỳnh quang kế dưới dạng ống nghiệm nhỏ gọn (compact tube fluorometers) và máy đọc khay vi thể phát huỳnh quang (fluorescence microplate readers).

Huỳnh quang kế dưới dạng ống nghiệm nhỏ gọn

Compact Tube Fluorometers

Đây là dạng huỳnh quang kế được thiết kế dưới định dạng là một ống nghiệm PCR 0.5 mL. Chúng thường được các nhà sản xuất cung cấp theo bộ kit định lượng DNA và vì thế mà phù hợp riêng cho từng loại kit. Dù chúng có ưu điểm là giá cả rất phải chăng, chúng thường chỉ đo được ở 2 đôi bước sóng (wavelength pairs), do đó mà có thể không phù hợp với một số ứng dụng khác. Hơn nữa, chúng là dụng cụ thiết kế cho một mẫu (single-sample instruments), vì thế mà phép đo thực hiện trên một lượng lớn mẫu trở nên tốn thời gian. Đối với các phòng thí nghiệm sử dụng phát xạ huỳnh quang (fluorescence) cho những mục đích khác thì máy đọc khay vi thể (microplate reader) trở thành khoản đầu tư dài hạn tốt hơn.

Máy đọc khay vi thể phát huỳnh quang

Accordion Panel

Máy đọc khay vi thể phát huỳnh quang (fluorescence microplate readers) cung cấp hiệu suất làm việc và độ linh hoạt cao hơn hẳn so với huỳnh quang kế dưới dạng ống nghiệm nhỏ gọn (compact tube fluorometers). Ưu điểm mà các dạng khay vi thể (microplate format) và thể tích mẫu đem lại đã được thảo luận ở phần trên. Đối với phép đo phát xạ huỳnh quang, thể tích mẫu lại không quá quan trọng bởi điều chúng ta cần là xem xét thể tích chất phản ứng thêm vào mẫu sao cho đạt được ngưỡng thể tích làm việc tối thiểu của khay vi thể (minimum working volume of the microplate). Định lượng huỳnh quang DNA (DNA fluorescence quantification) không cần sử dụng tham số chuẩn hóa độ dày truyền quang (pathlength correction) bởi một đồ thị chuẩn (standard curve) đã được dùng để tính nồng độ thay vì áp dụng công thức Beer-Lambert.

Xét về các dòng máy đọc khay vi thể (microplate reader), đa số các đầu đọc (readers) đều phù hợp nếu chúng có thể điều chỉnh bước sóng kích thích và phát xạ khuyên dùng (recommended excitation and emission wavelengths). Dòng máy dựa trên kính lọc (filter-based instruments) mang tới độ nhạy cao hơn, trong khi đó, dòng máy dựa trên bộ phận đơn sắc hóa (monochromator-based instruments) lại cho phép thao tác linh hoạt hơn. Có rất nhiều thuốc nhuộm phổ biến dùng trong định lượng DNA có thể đo được bằng kính lọc fluorescein tiêu chuẩn (fluorescein filters), nhưng trước khi mua bất kỳ bộ kit định lượng DNA nào, bạn hãy kiểm tra xem dụng cụ của mình đã có kính lọc phù hợp chưa. Nếu bạn đang làm việc gần vùng giới hạn nhận diện (detection limit) của bộ kit, bạn nên chuẩn bị thử nghiệm các sự kết hợp khác nhau của kính lọc nhằm đạt được tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (signal-to-noise) tốt nhất.

MÁY ĐỌC ĐA CHẾ ĐỘ

MULTIMODE READERS

Máy đọc khay vi thể đa chế độ (multimode microplate readers) có thể được điều chỉnh để đo được cả độ hấp thụ quang (absorbance) và phát xạ huỳnh quang (fluorescence), cho phép bạn định lượng DNA bằng bất kể phương pháp nào khi cần.

SO SÁNH CÁC CÔNG CỤ SỬ DỤNG TRONG ĐỊNH LƯỢNG DNA

Công cụ

Dạng mẫu

Thể tích mẫu tối thiểu

Ưu điểm

Hạn chế

Máy quang phổ kế đo thể tích micro (microvolume spectrophotometers)

Giọt (drop)

1 µL (thông thường); 0.3 µL ở một số dụng cụ
  • Nhanh chóng và thuận tiện
  • Thể tích mẫu thấp nhất
  • Hiệu suất làm việc thấp
  • Chỉ đo hấp thụ quang (absorbance)

Máy đọc khay vi thể* (microplate reader)

Đĩa 96 giếng

25-50 µL
  • Hiệu suất làm việc cao
  • Máy đọc đa chế độ (multimode readers) có thể được sử dụng cho cả hai phương pháp dựa trên độ hấp thụ quang (absorbance-based) và phát xạ huỳnh quang (fluorescence-based)
  • Có thể cần tới thể tích mẫu lớn tùy thuộc vào phương pháp và đĩa vi thể (microplate)
  • Có thể cần tới đĩa vi thể đặc biệt (special microplates) và tham số chuẩn hóa độ dày truyền quang (pathlength correction) cho phép định lượng DNA dựa trên độ hấp thụ quang

 
 

Đĩa 96 giếng, nửa phần

15-25 µL
 

Đĩa 384 giếng

10-20 µL
 

Đĩa 384 giếng, thể tích nhỏ

2-5 µL
 

Đĩa 1536 giếng

1-2 µL
Huỳnh quang kế dạng ống nghiệm (tube fluorometer) Ống 0.5 mL V1-20 µL
  • Giá cả phải chăng
  • Tối ưu hóa cho từng bộ kit chuyên biệt
  • Hiệu suất làm việc thấp
  • Chỉ đo phát xạ huỳnh quang (fluorescence)
  • Không phù hợp cho các bộ kits hoặc ứng dụng khác

*Xét cả máy đọc khay vi thể đa chế độ (multimode microplate readers), đo độ hấp thụ quang (absorbance) và phát xạ huỳnh quang (fluorescence)

CÁC SẢN PHẨM LIÊN QUAN

Máy quang phổ kế đo thể tích micro Colibri LB 915

Colibri LB 915 Microvolume Spectrophotometer

Đĩa µDrop dành cho phép đo thể tích thấp

μDrop Plate for low-volume measurements

Tìm kiếm nhanh dịch vụ Berthold tại Việt Nam

Office: 11/84 Ngoc Khanh Street, Ba Dinh District, Hanoi VIETNAM

Mr. Mark Pham

Phone: +84 903 114 883

Email: bio@berthold.vn

Liên hệ với chúng tôi ngay hôm nay để tìm hiểu về những sản phẩm đo lường chính xác trong Sinh học Phân Tử và Y Sinh.

 

Liên hệ