ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ TINH SẠCH DNA LÊN PHÉP ĐỊNH LƯỢNG

Phương pháp xác định độ tinh sạch DNA

DNA tinh sạch bị nhiễm dẫn tới rất nhiều vấn đề, từ việc định lượng không chính xác hoặc xác định không đúng vật liệu ban đầu (starting material) cho tới ảnh hưởng của chất gây nhiễm (contaminant) lên những thí nghiệm sau. Tìm hiểu rõ hơn những cách bạn có thể làm để đạt được độ tinh sạch cho DNA và loại bỏ sự thiếu chính xác do tạp nhiễm (contamination inaccuracies).

ĐỘ TINH SẠCH DNA TRONG PHƯƠNG PHÁP ĐO ẢNH PHỔ TIA UV

DNA PURITY IN UV SPECTROPHOTOMETRY

Như chúng ta đã thảo luận ở phần các phương pháp định lượng DNA, phép đo độ hấp thụ của mẫu ở 260 nm là một phương pháp phổ biến dùng trong định lượng nồng độ DNA. Tuy nhiên, một số đại phân tử khác cũng hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm mà đa phần là proteins và RNA và cũng có cả những chất sử dụng trong quá trình tinh sạch. Việc mẫu bị nhiễm bởi những chất có độ hấp thụ quang ở 260 nm dẫn tới những đánh giá sai về nồng độ thực tế của DNA (lầm tưởng DNA có nồng độ cao) do đó có thể không đáp ứng đủ nồng độ DNA cho chu trình thí nghiệm sau. Những chất gây nhiễm này (impurities) có thể được ước lượng bằng cách đo độ hấp thụ quang của mẫu ở bước sóng khác 260 nm.

 

A340

Các hạt (particles) trong thể vẩn (suspension) có thể được nhận biết nhờ độ hấp thụ quang ở bước sóng vào khoảng 340 nm (hoặc 320 nm). Các chất này thường không gây ảnh hưởng tới những thí nghiệm sau do đó chúng ta thường trừ phép đo độ hấp thụ (absorbance measurement) cho giá trị A340 nhằm chỉnh sửa lại ảnh hưởng của các hạt (particles) lên phép định lượng. Phép trừ này còn được gọi là phép chuẩn hóa quang phổ (spectrum normalization).

Hạn chế của phương pháp đo ảnh phổ tia UV trong việc tiếp cận độ tinh sạch DNA

Giới hạn dưới mà phương pháp đo ảnh phổ tia UV (UV spectrophotometry) có thể nhận diện được thông thường rơi vào 2 ng/µL DNA. Nói cách khác, phương pháp này không thể sử dụng được nếu muốn xác định độ tinh sạch của mẫu DNA có nồng độ dưới 2 ng/µL DNA. Kể cả nếu giá trị nồng độ đạt ngưỡng gần giới hạn (detection limit), cả hai tỉ lệ A260/A280 lẫn A260/A230 đều không còn chính xác trong việc tiếp cận độ tinh sạch DNA. Đó là do giá trị thu được quá gần giới hạn nhận diện (detection limit) của dụng cụ. Ở khoảng này, độ biến thiên của phép đo (the variability of the measurement) so với giá trị đo thu được là quá lớn. Hơn nữa, các giá trị A280 và A230 còn thấp hơn cả A260 và gần với giới hạn nhận diện (detection limit) của dụng cụ. Ví dụ, giả sử ta có giá trị A260 của một mẫu có nồng độ DNA tinh sạch là 2 ng/µL bằng 0.04, do đó, giá trị A280 lý thuyết của mẫu này sẽ là 0.02. Nhưng nếu chỉ với giao động giá trị bằng 0.01 sẽ khiến tỉ lệ này đi từ 4.00 (với giao động bằng -0.01 cho giá trị đo được của A280 là 0.01) tới 1.33 (với giao động bằng +0.01 cho giá trị A280 thu được là 0.03). Do đó, việc tỉ lệ mang giá trị âm là rất bình thường vì giá trị A280 hoặc A230 có thể xuống dưới 0.

Tỉ lệ A260/A280 

Proteins có độ hấp thụ quang cao hơn ở bước sóng 280 nm so với 260nm. Tỉ lệ giữa độ hấp thụ quang ở 260 (A260) và 280 nm (A280) được chấp nhận rộng rãi là phương thức xác định mẫu DNA tinh sạch bị nhiễm protein. Tỉ lệ A260/A280 của mẫu chứa DNA tinh sạch đơn thuần không bị nhiễm protein sẽ có giá trị từ 1.8 tới 2.0. Nếu giá trị này nhỏ hơn 1.8 thì chứng tỏ mẫu đã bị tạp nhiễm bởi protein, còn với giá trị lớn hơn 2.0, con số lại thể hiện tạp nhiễm gây ra do RNA. Tỉ lệ A260/A280 có giá trị thấp cũng có thể do trong mẫu còn tồn đọng phenol, đó là một phụ chất (additive) sử dụng trong một số phương pháp tinh sạch DNA.

Độ nhạy của tỉ lệ A260/A280 trong việc xác định tạp nhiễm protein là rất thấp. Ví dụ nếu tỉ lệ này bằng 1.75, chỉ 0.05 ít hơn giá trị 1.8 – cũng có thể chỉ ra rằng mẫu đang chứa một lượng protein tạp nhiễm khoảng 50%. Trong ví dụ này, nồng độ DNA của chúng ta có thể chỉ đạt được một nửa lượng đã được tính bởi A260. Trong khi một số thiết bị có thể hiệu chỉnh lại đúng nồng độ DNA dựa trên phổ của mẫu (samples’ spectrum) rút ra từ phổ DNA tinh sạch theo lý thuyết (theoretical spectrum of pure DNA), phải có một lượng protein đủ lớn thì độ sai khác mới có thể xác định được khiến cho chức năng này không còn đáng tin cậy nữa.

Hạn chế của phương pháp đo ảnh phổ tia UV trong việc tiếp cận độ tinh sạch DNA

Giới hạn dưới mà phương pháp đo ảnh phổ tia UV (UV spectrophotometry) có thể nhận diện được thông thường rơi vào 2 ng/µL DNA. Nói cách khác, phương pháp này không thể sử dụng được nếu muốn xác định độ tinh sạch của mẫu DNA có nồng độ dưới 2 ng/µL DNA. Kể cả nếu giá trị nồng độ đạt ngưỡng gần giới hạn (detection limit), cả hai tỉ lệ A260/A280 lẫn A260/A230 đều không còn chính xác trong việc tiếp cận độ tinh sạch DNA. Đó là do giá trị thu được quá gần giới hạn nhận diện (detection limit) của dụng cụ. Ở khoảng này, độ biến thiên của phép đo (the variability of the measurement) so với giá trị đo thu được là quá lớn. Hơn nữa, các giá trị A280 và A230 còn thấp hơn cả A260 và gần với giới hạn nhận diện (detection limit) của dụng cụ. Ví dụ, giả sử ta có giá trị A260 của một mẫu có nồng độ DNA tinh sạch là 2 ng/µL bằng 0.04, do đó, giá trị A280 lý thuyết của mẫu này sẽ là 0.02. Nhưng nếu chỉ với giao động giá trị bằng 0.01 sẽ khiến tỉ lệ này đi từ 4.00 (với giao động bằng -0.01 cho giá trị đo được của A280 là 0.01) tới 1.33 (với giao động bằng +0.01 cho giá trị A280 thu được là 0.03). Do đó, việc tỉ lệ mang giá trị âm là rất bình thường vì giá trị A280 hoặc A230 có thể xuống dưới 0.

Tỉ lệ A260/A230 

Proteins không phải chất gây nhiễm (contaminant) duy nhất trong mẫu DNA tinh sạch. Một số chất gây nhiễm (contaminants) cũng khiến độ hấp thụ quang cao hơn ở bước sóng 230 nm so với 260 nm, do vậy, tỉ lệ A260/A230 lại được sử dụng để xác định độ tinh sạch của DNA. Tỉ lệ A260/A280 của mẫu DNA tinh sạch có giá trị là 1.8. Tỉ lệ với giá trị thấp hơn cho thấy tạp nhiễm mẫu gây ra bởi phenol, EDTA, guanidine thiocyanate, Triton X-100 hoặc cacbohydrat. Tạp nhiễm bởi protein cũng làm tăng tỉ lệ này, nhưng tỉ lệ A260/A280 thì phù hợp hơn trong chỉ thị tạp nhiễm protein do nó không bị ảnh hưởng bởi quá nhiều chất gây nhiễm (contaminants) có thể có.

Hạn chế của phương pháp đo ảnh phổ tia UV trong việc tiếp cận độ tinh sạch DNA

Giới hạn dưới mà phương pháp đo ảnh phổ tia UV (UV spectrophotometry) có thể nhận diện được thông thường rơi vào 2 ng/µL DNA. Nói cách khác, phương pháp này không thể sử dụng được nếu muốn xác định độ tinh sạch của mẫu DNA có nồng độ dưới 2 ng/µL DNA. Kể cả nếu giá trị nồng độ đạt ngưỡng gần giới hạn (detection limit), cả hai tỉ lệ A260/A280 lẫn A260/A230 đều không còn chính xác trong việc tiếp cận độ tinh sạch DNA. Đó là do giá trị thu được quá gần giới hạn nhận diện (detection limit) của dụng cụ. Ở khoảng này, độ biến thiên của phép đo (the variability of the measurement) so với giá trị đo thu được là quá lớn. Hơn nữa, các giá trị A280 và A230 còn thấp hơn cả A260 và gần với giới hạn nhận diện (detection limit) của dụng cụ. Ví dụ, giả sử ta có giá trị A260 của một mẫu có nồng độ DNA tinh sạch là 2 ng/µL bằng 0.04, do đó, giá trị A280 lý thuyết của mẫu này sẽ là 0.02. Nhưng nếu chỉ với giao động giá trị bằng 0.01 sẽ khiến tỉ lệ này đi từ 4.00 (với giao động bằng -0.01 cho giá trị đo được của A280 là 0.01) tới 1.33 (với giao động bằng +0.01 cho giá trị A280 thu được là 0.03). Do đó, việc tỉ lệ mang giá trị âm là rất bình thường vì giá trị A280 hoặc A230 có thể xuống dưới 0.

TIẾP CẬN ĐỘ TINH SẠCH DNA NHỜ THUỐC NHUỘM PHÁT XẠ HUỲNH QUANG

DNA PURITY USING FLUORESCENT DYES

Do thuốc nhuộm phát xạ huỳnh quang chỉ có sẵn cho các dòng axít nucleic đặc hiệu (ví dụ, DNA sợi đơn), tạp nhiễm bởi protein hoặc do những dòng axít nucleic khác có ảnh hưởng rất ít lên quá trình định lượng DNA nếu sử dụng phương pháp này. Do đó, nếu độ tinh sạch DNA trong mẫu không được tốt, nồng độ DNA ghi nhận bởi giá trị A260 có thể cao hơn khi được ghi nhận bằng thuốc nhuộm phát huỳnh quang. Tuy nhiên, định lượng DNA sử dụng thuốc nhuộm phát xạ huỳnh quang không tiên liệu trực tiếp được sự xuất hiện của các tác nhân gây nhiễm (contaminants) (mà có thể đóng vai trò rất quan trọng, ví dụ như để đánh giá những ảnh hưởng có thể xảy ra lên các thí nghiệm sau). Nếu protein hoặc RNA gây tạp nhiễm cần được định lượng (ví dụ như, để tối ưu hóa quá trình tinh sạch), thao tác phải tiến hành đó là lấy rất nhiều lượng mẫu xác định (multiple aliquots) và định lượng từng loại đại phân tử riêng rẽ.

TÍNH ĐỒNG NHẤT CỦA AXÍT NUCLEIC

NUCLEIC ACID INTEGRITY

Cuối cùng, bài thảo luận dành ra một phần để đề cập tới việc đánh giá tính đồng nhất của axít nucleic và nhất là phân tử RNA. Dù quang phổ của mẫu cung cấp thông tin rất đầy đủ về độ tinh sạch của axít nucleic được tách chiết (cho dù phổ có sai khác so với phổ của mẫu axít nucleic tinh sạch, do vậy mà biểu hiện độ tinh sạch thấp), nó không hề cung cấp bất kỳ thông tin gì về tính đồng nhất của mẫu. Điều này là do quang phổ hấp thụ của các nucleotit tự do cũng tương tự với các nucleotit thành phần của phân tử DNA hoặc RNA lớn.

Để tiếp cận tính đồng nhất của RNA, phương pháp tốt nhất vẫn là chạy điện di trên gel và quan sát RNA sử dụng thuốc nhuộm xen phân tử (intercalating dye). Sự xuất hiện của các vệt có khối lượng phân tử thấp (lower molecular weight smears) biểu thị quá trình phân rã của RNA (RNA degradation). Cường độ tương đối của 28S và 18S ribosome RNA (rRNA) có thể được sử dụng để tính độ đồng nhất của RNA, với tỉ lệ 2:1 thể hiện phân tử RNA nguyên vẹn (intact RNA).

 

 

Tìm kiếm nhanh dịch vụ Berthold tại Việt Nam

Office: 11/84 Ngoc Khanh Street, Ba Dinh District, Hanoi VIETNAM

Mr. Mark Pham

Phone: +84 903 114 883

Email: bio@berthold.vn

Liên hệ với chúng tôi ngay hôm nay để tìm hiểu về những sản phẩm đo lường chính xác trong Sinh học Phân Tử và Y Sinh.

 

Liên hệ