CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THUỐC TƯƠNG TÁC PROTEIN-PROTEIN 

Có nhiều phương pháp có sẵn để nghiên cứu các tương tác protein-protein, và mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm khác nhau. Chúng khác nhau về loại tương tác mà chúng có thể phát hiện, loại protein chúng có thể được sử dụng, số lượng dương tính giả và âm tính giả, dụng cụ cần thiết, v.v. Các phương pháp in vivo được thực hiện trong các tế bào hoặc sinh vật sống và do đó có lợi thế lớn trong việc bảo tồn môi trường xung quanh nơi tương tác diễn ra và được theo dõi. Ngoài ra, nhiều người trong số họ sử dụng huỳnh quang hoặc phát quang để định lượng tương tác protein-protein một cách linh hoạt, rất có lợi. Do những ưu điểm quan trọng này, các phương pháp in vivo là trọng tâm của phần này.

 

PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP TRONG VIVO ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ NGHIÊN CỨU TƯƠNG TÁC THUỐC PROTEIN-PROTEIN

 

Có nhiều cách để phân loại các phương pháp in vivo được sử dụng để nghiên cứu tương tác protein-protein . Nếu trọng tâm đặc biệt là phát hiện và định lượng tương tác, nó có thể được phân loại bằng các thuộc tính của hệ thống phóng viên được sử dụng bởi các phương thức tương ứng.

Tất cả các phương pháp được trình bày ở đây đều dựa trên một hệ thống phóng viên gồm hai phần: một phần được liên kết với một trong những protein quan tâm (đôi khi được gọi là protein mồi mồi bẫy) và phần còn lại với protein quan tâm khác (đôi khi được gọi là protein con mồi protein protein). Khi cả hai protein tương tác với nhau, hai phần của hệ thống phóng viên được đưa đến gần nhau và có tác dụng phát hiện rõ ràng. Các thuật ngữ ăn mồi và các món ăn khác thường được sử dụng nếu có một loại protein quan tâm và mục tiêu là để săn lùng các mối quan hệ tương tác. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp cả hai đối tác đều đã biết và mục tiêu là nghiên cứu sự tương tác chi tiết hơn (ví dụ: quy định của nó).

Các phương pháp được đề cập dưới đây được thảo luận chi tiết hơn trong  Xing et al. 2016.

 

CÁC PHƯƠNG PHÁP THEO CHỨC NĂNG CỦA HỆ THỐNG CHỈ THỊ

 

An important difference is whether the two parts of the reporter system are fully functional by themselves or not.

 

XÉT NGHIỆM BỔ SUNG ĐOẠN PROTEIN (PCA)

Trong các thử nghiệm bổ sung đoạn protein (PCA), chỉ thị là một protein duy nhất đã được phân tách thành hai mảnh. Bản thân các mảnh vỡ không có chức năng, nhưng protein có thể tự phục hồi khi cả hai mảnh được đặt gần nhau và khôi phục chức năng của nó. Ví dụ, trong thử nghiệm bổ sung luciferase phân tách, phân tử luciferase được chia thành hai mảnh, cả hai đều không thể tạo ra ánh sáng, nhưng nếu cả hai mảnh đủ gần, luciferase được tái tạo và có thể tạo lại ánh sáng. Ví dụ về các phương pháp PCA là hệ thống ubiquitin phân tách và xét nghiệm bổ sung luciferase phân tách.

In the protein fragment Complementation Assays (PCA), the reporter is a single protein that has been cleaved into two fragments. The fragments by themselves are not functional, but the protein can reconstitute itself when both fragments are brought into close proximity and restore its functionality. For example, in the split luciferase complementation test, the luciferase molecule is split into two fragments, neither of which can produce light, but if both fragments are close enough, the luciferase is reconstituted and can produce light again. Examples of PCA methods are the split ubiquitin system and the split luciferase complementation assay.

Sàng lọc hai vật lai

Trong các sàng lọc hai vật lai, mỗi phần của hệ thống pchỉ thị là một miền protein hoặc protein có đầy đủ chức năng, nhưng một hiệu ứng cụ thể, có thể đo được được tạo ra khi cả hai phần đều đủ gần. Ví dụ, trong các sàng lọc lai hai loại men, cả miền liên kết DNA được liên kết với một trong các protein quan tâm và miền giao dịch được liên kết với protein khác đều ổn định và hoạt động độc lập, nhưng gen phóng viên chỉ được biểu hiện nếu chúng ở gần nhau. Tương tự, cả hai protein huỳnh quang được sử dụng trong xét nghiệm FRET đều là huỳnh quang, nhưng protein chấp nhận chỉ phát ra ánh sáng nếu có sự tương tác giữa các protein quan tâm.

PHƯƠNG PHÁP THEO DẤU HIỆU CỦA ĐẦU DÒ

METHODS ACCORDING TO THE DETECTED SIGNAL

Một phân loại quan trọng khác là chỉ thị những tín hiệu được tạo ra và được sử dụng để phát hiện sự tương tác. Điều này ảnh hưởng đến các thiết bị cần thiết để phát hiện, các khả năng mà nó cung cấp để định lượng chính xác và sự phù hợp để phân tích thông lượng cao và tương tự.

 

Methods based on gene expression

In this type of method, if both proteins of interest interact, the combination of the DNA-binding domain and the transactivation domain drives the expression of the reporter. Reporters are normally of two possible types: prototrophic markers, such as HIS3 or ADE2, enabling survival on depleted growth medium, or chromogenic enzymes such as ß-galactosidase, which can be used for the selection via blue/white coloring of the colonies. Both the yeast two-hybrid assay and the split-ubiquitin system (see below) are based on gene expression.

This type of reporter is not capable of following dynamic changes in the interaction, and can only be quantified by absorption and by using a chromogenic enzyme. However, such reporters can be used to evaluate large numbers of binary interactions by mixing two haploid mating types that have been transformed with different sets of proteins of interest. Hence, they are very useful for large scale screening of protein-protein interactions.

In the classical version of this method the N-terminal DNA-binding domain of the transcriptional activator GAL4 is bound to one protein of interest, and the C-terminal transactivation domain to the other one. When both proteins interact, their association produces a chimeric transcription factor, that activates gene expression downstream of the upstream activation sequence GAL1 (Fields and Song 1989). Further split probes have been successfully established. The yeast two-hybrid assay is easy to perform, but can only be used to study interactions between proteins with nuclear localization.

This system is similar in concept to the yeast two-hybrid system and is just as easy to implement. However, it has the additional advantage that it can be applied to virtually any protein, not only to nuclear proteins. As explained above, the split-ubiquitin system is a kind of PCA: the protein ubiquitin is split into two non-functional fragments, each of which is fused to one member of the protein pair of interest. When both fragments interact, ubiquitin reassembles and becomes functional. This promotes cleavage via the ubiquitin-specific protease. In the classical version, this cleavage leads to the release of a transcription factor, that then activates the expression of the reporter gene.

Methods based on fluorescence intensity

Fluorescent proteins are used to detect interactions. Although all fluorescence-based methods have a higher sensitivity and a higher dynamic range than methods based on gene expression of chromogenic enzymes, not all of them are suitable for following dynamic interaction changes.

The most widely used method of fluorescence is FRET. In this method, the fluorescent donor protein is coupled to one of the proteins of interest and the acceptor to the other protein. If there is no interaction, only the fluorescence of the donor should be detected. However, if an interaction takes place (with both fluorescent proteins at a distance of 10 nm or closer), the fluorescent donor protein can excite the acceptor via resonance energy transfer (dipole-dipole coupling). It is normal that some emission of the acceptor is detected even without interaction. This happens because often a small portion of the excitation light is also able to excite the acceptor if there is a spectral overlap in the excitation of the two fluorescent proteins – even if suitable filters are used. Therefore, the FRET ratio (emission of the acceptor divided by emission of the donor) is normally used for quantification, with a significant increase in the ratio indicating an interaction. This type of FRET is sometimes referred to as Sensitized Emission FRET (SE-FRET or seFRET). However, since SE-FRET is the only common method used to measure FRET with a microplate reader, it is usually referred to simply as FRET. Other types of FRET used with fluorescence microscopes are FLIM FRET (see below) and FRET acceptor photobleaching (where the increase in fluorescence of the donor is measured after the photobleaching of the acceptor).

Like most methods based on fluorescence intensity, FRET suffers from a high background and therefore low signal-to-noise ratios, which limits its sensitivity. Several alternative methods have been developed to overcome this limitation: BRET (see below) and TR-FRET. In TR-FRET (time-resolved FRET), fluorophores with a very long fluorescence lifetime (mostly chelates of lanthanides, such as europium, terbium and samarium) are used to bypass interference from molecules with a short fluorescence lifetime or other factors (especially excitation light). Instead of measuring light when excitation light is on, TR-FRET measurements are performed hundreds of microseconds later. The chelates can still emit light, but all other fluorophores in the sample and of course the excitation light have already faded away. Time resolved fluorescence (TRF) is not to be confused with fluorescence lifetime (see below).

BiFC is a PCA that uses a cleaved fluorescent protein (GFP or another). Fragments of the protein are not fluorescent, but the fluorescent protein is reconstituted when both fragments are brought into close proximity. Similar to FRET, BiFC is a fluorescent method for measuring PPI, but there is one important difference: the complementation of the cleaved fluorescent protein fragments is irreversible, making the method unsuitable for investigating interaction dynamics. Another complication with this method is that the cleaved fragments eventually reassemble by themselves, which increases the detection of false positives and requires extreme care in planning the experiment and designing appropriate controls. However, the fact that BiFC is irreversible can become an advantage: It can be used to identify and quantify weak interactions that are difficult to investigate with other methods.

FLIM FRET

An interesting phenomenon is that FRET not only increases the fluorescence emission of the acceptor but also reduces the fluorescence lifetime of the donor due to energy transfer. The combination with FLIM to visualize FRET enables PPI to be investigated in vivo with high reliability, enabling highly dynamic spatiotemporal resolution. However, a successful use of FLIM requires sophisticated hardware add-ons and extensive training.

Fluorescence lifetime measurements can also be performed with a fluorometer. While there are a number of single sample fluorometers that can perform this procedure, the availability of microplate readers that can perform high-throughput fluorescence lifetime measurements is very limited.

Methods based on luminescence

Luminescent reporter systems such as the split-luciferase complementation assays are also popular. Here, the reporter is a luciferase and emitted light can be easily quantified using a luminescence reader.

This is a PCA based on the complementation of two cleaved fragments of a luciferase protein and its subsequent detection by substrate conversion and light production. The method is very similar to BiFC but uses a luciferase instead of a fluorescent protein.  However, there is an important difference: the reconstitution of luciferase is reversible in most cases, and therefore suitable for monitoring dynamic interactions in real time. Since most model organisms are not luminescent, split luciferase complementation is a very sensitive detection system with a high signal-to-noise ratio. Both Firefly luciferase and Renilla luciferase have been successfully used to study PPI in vivo. Split luciferase implementation is a popular method to study protein-protein interactions in planta by using a plant in vivo imaging system to visualize luminescence on transformed leaves.

All methods discussed here are summarized in the table below:

BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) was developed to bypass some of FRET’s background problems. Instead of using a fluorescent protein as a donor, a luciferase is used instead. However, since luciferases produce light through a chemical reaction, an external light source is not required for excitation. BRET therefore has a very small background and does not suffer from problems often associated with FRET, such as autofluorescence, light scattering or photo bleaching.

The classification of BRET as a luminescence method is therefore controversial: while the measured signal represents the emission of a fluorescent protein (e.g. eYFP for BRET1 and GFP for BRET2), the excitation lamp cannot be used (since the acceptor is excited by the donor luciferase via dipole-dipole coupling). For the detection of BRET, luminescence readers are therefore used instead of fluorescence readers, which is why this technique is often classified as a luminescence method for practical reasons.

All methods discussed here are summarized in the table below:

Comparison of In Vivo methods to study PPI

In Vivo PPI Methods
Method

Signal

Dynamic? Large-scale screening of PPIs? Comments
Yeast Two Hybrid system Bacterial survival/color (absorbance) No Yes

Inexpensive, but limited to nuclear proteins

Split-ubiquitin system Bacterial survival/color (absorbance) No Yes Inexpensive
FRET (SE FRET) Fluorescence intensity Yes No High background
TR-FRET Time-Resolved fluorescence intensity Yes No Reduced background compared to FRET
BiFC Fluorescence intensity No No May be useful to detect weak interactions
FLIM FRET Fluorescence lifetime Yes No

Very reliable, but sophisticated equipment required

Split-luciferase complementation Luminescence Yes No Exogenous substrate needed
BRET Luminescence/Fluorescence Yes No Reduced background compared to FRET; exogenous substrate needed

Tìm kiếm nhanh dịch vụ Berthold tại Việt Nam

Office: 11/84 Ngoc Khanh Street, Ba Dinh District, Hanoi VIETNAM

Mr. Mark Pham

Phone: +84 903 114 883

Email: bio@berthold.vn

Liên hệ với chúng tôi ngay hôm nay để tìm hiểu về những sản phẩm đo lường chính xác trong Sinh học Phân Tử và Y Sinh.

 

Liên hệ