CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG DNA

Những trở ngại và giải pháp

DNA thông thường được định lượng bằng phương pháp đo ảnh phổ (spectrophotometry) trong nhiều phòng thí nghiệm, tuy nhiên phương pháp này có một số nhược điểm và không đặc hiệu hoặc đủ nhạy đối với một số thí nghiệm. Có rất nhiều phương pháp có thể được sử dụng để thay thế với ưu và nhược điểm riêng cho mỗi loại nhưng điểm khác biệt giữa chúng là thể tích mẫu, thiết bị và những yêu cầu chuyên biệt. Bài viết sau đây sẽ đề cập tới các phương pháp định lượng DNA hiện hành khác nhau.

PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN ĐỘ HẤP THỤ QUANG 

METHODS BASED ON ABSORBANCE

Phương pháp đo ảnh phổ tia UV sử dụng bước sóng hấp thụ quang 260nm

Hấp thụ quang (absorbance) từ hàng thập kỷ trước đã trở thành phương pháp được tin dùng trong định lượng DNA và RNA thông thường. Đây là một phương pháp đơn giản và dễ dàng thao tác vì nó không yêu cầu việc xử lý mẫu phức tạp (ngoại trừ tách DNA) hay đòi hỏi thực hiện phản ứng với các chất khác. Tuy nhiên, nó không đặc hiệu (chỉ có thể thực hiện phép đo axít nucleic tổng số) và rất nhạy với các chất gây nhiễm (contaminants) nên phương pháp này cần DNA phải có độ tinh sạch cao thì phép đo mới thật sự chính xác. Hãy tìm hiểu thêm về độ tinh sạch của DNA, cần thực hiện những thao tác gì để xác định độ tinh sạch này cũng như tầm ảnh hướng của nó tới phép định lượng.

Các mẫu DNA hấp thụ bước sóng 260 nm thường được đo bằng máy quang phổ kế ở thể tích micro (microvolume spectrophotometer), tuy nhiên phép đo cũng có thể được thực hiện bằng máy quang phổ kế sử dụng chậu thủy tinh (cuvette) hoặc máy đọc khay vi thể (microplate reader).

Ở phương pháp này, nồng độ của một chất sẽ được tính theo định luật Beer-Lambert dựa trên độ hấp thụ quang (absorbance) của chất đó. Công thức sau được rút ra từ công thức gốc của định luật:

Tại đó, A = độ hấp thụ quang ở một bước sóng nhất định (absorbance at a given wavelength), Ɛ = độ hấp thụ quang riêng (extinction coefficient), b = độ dày truyền quang (pathlength of the spectrophotometer), c = nồng độ mẫu (concentration of the sample).

Vậy nên, nếu độ dày truyền quang (pathlength) bằng 1 cm, nồng độ mẫu sẽ bằng độ hấp thụ ở 260 nm (độ hấp thụ quang cực đại của axít nucleic) chia cho độ hấp thụ quang riêng (extinction coefficient).

Công thức tính nồng độ DNA

DNA sợi kép có độ hấp thụ quang riêng (extinction coefficient) bằng 0.02 (µg/mL)-1 cm-1, do đó:

Công thức tương tự có thể áp dụng đối với từng độ hấp thụ quang riêng (extinction coefficients) của DNA sợi đơn (độ hấp thụ quang x 37 µg/mL) và RNA sợi đơn (độ hấp thụ quang x 40 µg/mL). Tuy nhiên, chúng ta cũng cần phải lưu ý rằng công thức này chỉ đúng cho phân tử axít nucleic có khối lượng lớn với tỉ lệ các nucleotit thành phần là tương đối giống nhau, ví dụ như DNA tổng số (genomic DNA), plasmids, vv. Đối với chuỗi oligo nucleotit hay những đoạn phân tử axít nucleic ngắn khác như micro RNA (miRNAs), độ hấp thụ quang riêng (extinction coefficient) phải được tính dựa theo trình tự của đoạn oligo nucleotit.

Các sản phẩm liên quan

Máy quang phổ kế đo thể tích micro Colibri LB 915

Colibri LB 915 Microvolume Spectrophotometer

Máy đọc khay vi thể đa chế độ Tristar 5

Tristar 5 Multimode Microplate Reader

Đĩa µDrop dành cho phép đo thể tích thấp

μDrop Plate for low-volume measurements

Phương pháp diphenylamine (Phương pháp kiểm tra Dische)

Một phương pháp khác dùng để định lượng DNA bằng độ hấp thụ quang đó là phương pháp diphenylamine. Phương pháp này dựa trên phản ứng màu giữa diphenylamine với đường deoxyribose tạo ra sản phẩm là một phức hệ có màu xanh. Tuy nhiên, phương pháp này tiêu tốn rất nhiều thời gian, lại có độ nhạy kém vậy nên không còn trở nên phổ biến trong các phòng thí nghiệm. Nhưng phép đo có thể được thực hiện trong vùng khả kiến ở bước sóng 595 nm bằng đĩa đọc ELISA (ELISA reader) chuẩn nếu không có sẵn dụng cụ tương thích.

PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN PHÁT XẠ HUỲNH QUANG

METHODS BASED ON FLUORESCENCE

Việc sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang cho phép định lượng DNA với độ nhạy cao hơn nhiều so với phương pháp đo độ hấp thụ quang bởi DNA (thông thường có độ nhạy cao hơn từ 10-100 lần tùy thuộc vào phương pháp cụ thể được so sánh). Thêm vào đó, các thuộc nhuộm đặc hiệu được sử dụng để nhuộm tùy loại axít nucleic nhất định như DNA sợi kép hay RNA, nhờ vậy mà tăng tính đặc hiệu cho phép định lượng cũng như giảm sự ảnh hượng của chất gây nhiễm (contaminants). Tuy nhiên, phương pháp dựa trên phát xạ huỳnh quang thường đắt đỏ hơn phép đo độ hấp thụ quang ở 260 nm và cần tới một đường cong tiêu chuẩn đã được thực hiện trước đó để đối chiếu. Phép đo phát xạ huỳnh quang được tiến hành bằng cách sử dụng máy đọc khay vi thể (microplate reader) hoặc huỳnh quang kế dành cho một ống đo (single-tube fluorometer).

Dụng cụ phục vụ thí nghiệm định lượng DNA

Có rất nhiều thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dyes) khác nhau chuyên dụng cho phản ứng định lượng DNA được sản xuất trên thị trường. Rất nhiều trong số đó được bao gồm trong các bộ kit đi kèm là mẫu DNA tiêu chuẩn (DNA standards), dung dịch đệm để hòa loãng (dilution buffers). Những điểm quan trọng sau đây rất cần được xét tới khi lựa chọn một bộ kit chuyên dụng:

  • Độ đặc hiệu của thuốc nhuộm: loại axít nucleic nào có thể đo được bằng thuốc nhuộm? Những lựa chọn phổ biến thường là các dòng thuốc nhuộm dành cho DNA sợi kép, RNA tuy nhiên chất phản ứng (reagents) dành cho DNS sợi đơn, micro RNA (miRNA) và các phân tử khác cũng có sẵn trên thị trường.
  • Phổ nhận diện (detection range): một số chất phản ứng có thể được sử dụng để nhận diện nồng độ DNA chỉ tới 10 pg/µL, tuy nhiên chúng có thể mất tính tuyến tính (linearity) ở nồng độ cao. Chất phản ứng sử dụng phải phù hợp với khoảng nồng độ mà bạn mong muốn đo được từ các mẫu. Thông tin này có thể được tìm thấy dễ dàng trong hướng dẫn sử dụng kit.
  • Yêu cầu về thể tích mẫu: nếu thể tích mẫu quá ít, hãy chú ý tới thể tích mẫu mà bộ kit yêu cầu bạn đáp ứng.
  • Dạng mẫu (sample format): một số kits được tối ưu hóa cho phép đo sử dụng ống nghiệm (single tubes) hoặc chậu thủy tinh (cuvettes). Bên cạnh đó, một số khác lại được thiết kế phù hợp với khay vi thể (microplate) dành cho các phòng thí nghiệm công suất cao (higher throughput laboratories). Tuy rằng đa phần các bộ kit định lượng DNA có thể dễ dàng mở rộng hoặc thu hẹp khả năng xử lý mẫu, việc chọn ra một bộ kit đã được tối ưu hóa dành riêng cho dạng mẫu của bạn vẫn tiết kiệm được nhiều hơn về mặt kinh phí và thời gian.
  • Tấm lọc (filters): rất nhiều thuốc nhuộm phổ biến dùng trong định lượng DNA có thể đo được bằng tấm lọc fluorescein tiêu chuẩn (fluorescein filters), nhưng trước khi chi trả cho bất kỳ chất phản ứng nào, bạn hãy kiểm tra xem dụng cụ của mình đã có tấm lọc phù hợp chưa. Nếu bạn đang làm việc ở vùng giới hạn nhận diện (detection limit) của bộ kit, bạn nên chuẩn bị thử nghiệm các sự kết hợp khác nhau của tấm lọc nhằm đạt được tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (signal-to-noise) tốt nhất.

PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN ĐIỆN DI

METHODS BASED ON ELECTROPHORESIS

Phương pháp điện di trên gel rất phổ biến đối với những mẫu DNA dưới dạng plasmid cần được định lượng. Ở phương pháp này, thuốc nhuộm huỳnh quang như ethidium bromide hoặc SYBR Green được thêm trực tiếp vào mẫu hoặc gel, kế đó, mẫu được điện di song song cùng với thang DNA (DNA ladder). Các băng (bands) điện di trên gel có thể được quan sát nhờ hệ thống ghi hình gel (gel documentation system) hoặc máy soi qua (transilluminator). Thang DNA bao gồm các băng có khối lượng định trước, do đó lượng DNA trong mẫu của chúng ta có thể được định lượng một cách tương đối bằng cách so sánh các băng mà chúng tạo ra với các băng thang DNA. Tuy đây là một phương pháp đặc hiệu và có khả năng loại trừ đa phần tạp chất (impurities) (vì DNA mong muốn đã được phân tách khỏi các axít nucleic khác hay các chất gây nhiễm (contaminants) nhờ điện di), nó rất tốn thời gian, không chính xác (vì phép định lượng chỉ được thực hiện qua giác quan đơn thuần hoặc sử dụng các phần mềm phân tích ảnh) và có độ nhạy thấp.

PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN PCR

METHODS BASED ON PCR

Định lượng DNA cũng có thể được thực hiện nhờ phản ứng chuỗi polymerase định lượng hay còn gọi là phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực (quantitative real-time PCR – qPCR) hoặc PCR kỹ thuật số (digital PCR) hay PCR kỹ thuật số giọt nhỏ (droplet digital PCR). PCR kỹ thuật số (digital PCR) thậm chí còn có thể định lượng axít nucleic mà không cần tới đồ thị tiêu chuẩn (standard curve), bởi các phân tử đã được phân tách nhờ phân bố Poisson. Điều này dẫn tới các sự kiện số trong từng ống phản ứng (dưới dạng chip hoặc giọt nhỏ (droplet)), sao cho tỉ lệ các phản ứng khuếch đại xảy ra trong các ống phản ứng tỉ lệ thuận với lượng chuỗi DNA đã được sử dụng, nhờ vậy chúng ta có thể dễ dàng xác định được lượng DNA một cách trực tiếp. Chu trình này có độ nhạy rất cao tuy nhiên lại cần các dụng cụ chuyên dụng đặc biệt và đắt tiền. Bên cạnh đó, phương pháp cũng cần tới những thao tác chuẩn bị thí nghiệm khá phức tạp và cần nhiều thời gian hơn các phương pháp đã được miêu tả trước đó.

SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG DNA

Phương pháp Độ nhạy Ưu điểm Hạn chế
Đo ảnh phổ tia UV (UV spectrophotometry) 2 ng/µL (thông thường, đo bằng máy quang phổ kế ở thể tích micro (microvolume spectrophotometer)  
  • Đơn giản
  • Nhanh chóng

 

  
  • Độ đặc hiệu thấp
  • Nhạy cảm với tác nhân gây nhiễm (contaminants)

 
Diphenylamine  3 μG  
  • CÓ THỂ ĐƯỢC ĐO BẰNG MÁY ĐO MÀU (COLORIMETER) HOẶC MÁY ĐỌC ELISA (ELISA READER)

 

  
  • TỐN CÔNG SỨC
  • TỐN THỜI GIAN

 
Phép đo phát xạ huỳnh quang (Fluorescence measurement) 10-50 pg/µL (thông thường, phụ thuộc vào bộ kit sử dụng)  
  • Độ đặc hiệu cao (theo từng loại axít nucleic)

 

  
  • Yêu cầu chất phản ứng với kinh phí cao

 
Điện di (Electrophoresis) 10 NG (THÔNG THƯỜNG, DỰA VÀO THANG ĐẶC HIỆU (SPECIFIC LADDER) VÀ ĐIỀU KIỆN TẠO ẢNH (IMAGING CONDITIONS))  
  • ĐỘ ĐẶC HIỆU RẤT CAO (BĂNG ĐẠI DIỆN CHO KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ ĐẶC HIỆU (BAND OF  A SPECIFIC MOLECULAR WEIGHT))
  

  • TỐN THỜI GIAN

  • ĐỘ CHÍNH XÁC THẤP

Tìm kiếm nhanh dịch vụ Berthold tại Việt Nam

Office: 11/84 Ngoc Khanh Street, Ba Dinh District, Hanoi VIETNAM

Mr. Mark Pham

Phone: +84 903 114 883

Email: bio@berthold.vn

Liên hệ với chúng tôi ngay hôm nay để tìm hiểu về những sản phẩm đo lường chính xác trong Sinh học Phân Tử và Y Sinh.

 

Liên hệ