NHỮNG ĐẶC ĐIỂM KỸ THUẬT CỦA BỘ PHẬN ĐƠN SẮC HÓA (MONOCHROMATOR) CÓ LIÊN QUAN TỚI MÁY ĐỌC KHAY VI THỂ (MICROPLATE READER)
Khoảng quang phổ/sóng ánh sáng (spectral/wavelength range)
Rất nhiều máy đọc khay vi thể (microplate reader) trên thị trường có dải hấp thụ (absorption range) từ 230 nm tới 1000 nm. Sử dụng hệ thống của chúng tôi, bộ phận đơn sắc hóa (monochromator) có thể chạm ngưỡng tối thiểu 200 nm. Xét về phép đo huỳnh quang (fluorescence), nhiều máy đọc khay vi thể (microplate readers) có thể đo tới giá trị cực đại lên tới 700 hoặc 740 nm. Thiết bị của chúng tôi có thể bao phủ phổ đo quang lên tới 850 nm.
Dải quang phổ (spectral bandwidth/bandpass)
Dải quang phổ (spectral bandwidth/bandpass) được định nghĩa là một khoảng rộng mà tại hai điểm đầu mút cường độ ánh sáng đạt giá trị bán cực đại (toàn độ rộng ở nửa cực đại – full width at half maximum, viết tắt trong tiếng Anh: FWHM) (Hình bổ trợ). Độ rộng của khe sáng (the slit) sẽ quyết định dải quang phổ (spectral bandwidth): khe sáng (the slit) càng rộng thì dải quang phổ (spectral bandwidth) càng hẹp. Rất nhiều máy đọc khay vi thể (microplate readers) trên thị trường có một dải quang phổ (spectral bandwidth) cố định. Tuy nhiên, máy đọc khay vi thể (microplate reader) của chúng tôi được trang bị bộ phận đơn sắc hóa (monochromator) có dải quang phổ (spectral bandwidth) biến thiên từ 4 nm (hoặc 6 nm, phụ thuộc vào thiết bị chuyên biệt) tới 22 nm. Dải quang phổ (spectral bandwidth) càng hẹp thì độ phân giải càng được cải thiện. Đặc tính này được khuyên dùng cho phương pháp huỳnh quang (fluorescence) khi đỉnh tín hiệu ánh sáng bị kích thích (excitation peak) và phát xạ (emission peak) ở rất sát nhau. Dải quang phổ (spectral bandwidth) rộng còn làm tăng tỷ số tín hiệu trên nhiễu (signal-to-noise ratio). bộ phận đơn sắc hóa (monochromator) mang dải quang phổ biến thiên như vậy sẽ rất hữu dụng cho việc tối ưu hóa những thí nghiệm phức tạp.
Hiệu suất chặn (blocking efficiency)
Hiệu suất chặn (blocking efficiency) là khả năng một hệ thống chọn lọc bước sóng chặn những sóng ánh sáng không đặc hiệu (unwanted wavelengths) (hoặc những bước sóng khác không nằm trong vùng được lựa chọn để phân tách bởi bộ phận đơn sắc hóa (monochromator)). Đây là một tham số quan trọng để đạt được một tỷ số tín hiệu trên nhiễu (signal-to-noise ratio) đáng mong đợi. Tham số này được biểu diễn bằng tỷ lệ ánh sáng không mong muốn đi ra khỏi bộ phận đơn sắc hóa (monochromator). Hiệu suất chặn (blocking efficiency) bằng 10E-3 có nghĩa rằng trong 1000 tia sáng không mong muốn thì sẽ có 1 tia không bị chặn và chiếu qua bộ phận đơn sắc hóa (monochromator). Đa phần các máy đọc khay vi thể (microplate reader) áp dụng cấu trúc tạo ánh sáng đơn sắc đôi (double monochromator) để đạt được hiệu suất chặn (blocking efficiency) bằng 10E-6. Phần lớn các thí nghiệm về cường độ huỳnh quang (fluorescence intensity assays) sử dụng hệ thống này.
Ánh sáng không đặc hiệu (stray light)
Ánh sáng không đặc hiệu (stray light) là lượng ánh sáng có bước sóng nhiễu được ghi lại và chiếu qua bộ phận đơn sắc hóa (monochromator). Bức xạ (radiation) này gây ra do sai sót trong cấu trúc của vật liệu tán sắc (dispersing element) hay những bề mặt quang (optical surfaces) khác, do các hiệu ứng nhiễu xạ (diffraction effects), quang sai (optical aberrations) hoặc do các thành phần của thiết bị đã cũ và bị hư hỏng.
Trong những phép đo độ hấp thụ quang (absorption), ánh sáng tán xạ (scattered light) gây ra những sai lệch trong định luật Lambert-Beer. Tại những giá trị hấp thụ quang (absorption) cao, mối quan hệ tuyến tính (linear relationship) giữa độ hấp thụ (absorption) và nồng độ bị ảnh hưởng rất nhiều bởi ánh sáng tán xạ (scattered light). Ở nồng độ cao với độ hấp thụ quang (absorption) thấp, nhân tố này còn tạo ra thiên kiến hệ thống (systematic bias). Ánh sáng không đặc hiệu (stray light) cũng là một tham số cơ bản ảnh hưởng tới giới hạn trên (upper limit) của khoảng tuyến tính động (linear dynamic range) trong một phép phân tích và gây trở ngại cho các phép đo huỳnh quang (fluorescence measurements).
Ánh sáng không đặc hiệu (stray light) được biểu diễn bằng phân số của ánh sáng truyền qua bộ phận đơn sắc hóa (monochromator). Con số 10E-4 nói lên rằng 1/10000 ánh sáng truyền qua bộ phận đơn sắc hóa (monochromator) là không đặc hiệu.
Trong khi những máy đọc khay vi thể (microplate reader) trên thị trường có chỉ số ánh sáng không đặc hiệu (stray light index) vào khoảng từ 3 x 10E-4 tới 5 x 10E-4, dòng máy sản xuất bởi Công nghệ Berthold (Berthold Technologies) có chỉ số vượt trội bằng 10E-6, tốt hơn những dòng máy phổ thông gấp 20 lần. Điều này tạo nên sự đáng tin cậy hàng đầu cho mọi phép đo thực hiện bởi bộ phận đơn sắc hóa (monochromator-based measurements).
Độ phân giải quang phổ (spectral resolution)
Độ phân giải (resolution) là độ rộng dải phổ tối thiểu (minimum bandpass) có thể cài đặt trên bộ phận đơn sắc hóa (monochromator); nếu vị trí của bộ phận này đã được cố định thì độ phân giải sẽ phụ thuộc vào độ rộng tối thiểu của khe sáng (minimum slit width). Độ phân giải (resolution) đóng vai trò rất quan trọng trong việc xác định dải phổ (spectrum) của một mẫu. Nếu đo ở độ phân giải thấp (low resolution), những đỉnh phổ nhọn (sharp spectral peaks) sẽ bị kéo dãn ra và thậm chí tín hiệu sẽ không xuất hiện nếu sử dụng khe sáng rộng (broad slit width). Nếu sử dụng một khe sáng hẹp (narrow slit), hình thái của phổ (spectrum shape) sẽ tiệm cận với nguyên bản ban đầu (original spectrum). Bạn có thể nhìn thấy ảnh hưởng của độ phân giải (resolution) lên bản quét phổ (spectral scan) như ở Hình 1. 3 đỉnh tín hiệu (peaks) nằm trong vùng sóng 500 nm đo ở độ phân giải (resolution) 4 nm có hình dạng dẹt hơn so với khi được đo ở 1 nm nhưng ta vẫn có thể dễ dàng phân biệt được 3 đỉnh. Tuy nhiên, nếu đo ở độ phân giải (resolution) 15 nm thì khó lòng nào có thể nhận ra 3 đỉnh này vì chúng đã bị chập làm một dẫn tới việc mất dữ liệu.
Nếu độ phân giải huỳnh quang (fluorescence resolution) của các máy trên thị trường chỉ đạt tới ngưỡng 9, 15 hay thậm chí 20 nm, bộ phận đơn sắc hóa (monochromator) ứng dụng trong máy đọc khay vi thể (microplate reader) của chúng tôi có độ phân giải quang phổ (spectral resolution) lên tới 4 hoặc 6 nm tùy thiết bị.
Hình 1. Tác động của độ phân giải quang phổ (spectral resolution) lên một bản quét phổ (spectrum scan)
